福建金线莲和台湾金线莲不同采收期多糖的变化
| [日期：2015-02-28] 发布者：福建山下坝农业科技有限公司 |
金线莲别名金蚕、金石松，为兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Auoectochilus）多年生草本植物，为民间珍稀药材，素有“金草”、“神药”、“鸟人参”等美称。金线莲全草入药，具有滋补、止痛等功效。《福建药物志》载：金线莲性平、味甘，具有清热凉血、祛风利湿等功效，主治咯血、支气管炎、肾炎、膀肤炎、糖尿病、乳糜尿、血尿、风湿性关节炎、小儿急惊风、毒蛇咬伤等症，民间多用于治疗小儿高烧不退、惊风等症。多糖是具有高活性的一类大分子生命物质，广泛分布于植物、动物和微生物中。近年来研究表明，金线莲富含的多糖类物质在抗癌、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等方面均具有重要作用。
目前金线莲的采收期缺乏标准，有在培养室生根壮苗培养4个月就采收的，也有生根壮苗培养4个月后，移至大棚培植1-3个月采收的，何时采收的金线莲品质更佳缺乏依据。因此，本试验以金线莲多糖为活性成分指标，研究福建金线莲和台湾金线莲在培养室生根壮苗培养阶段和大棚移栽培植阶段多糖含量的变化，旨在为两种金线莲的规范化栽培及适时采收提供参考。
一、材料与方法
1、材料
1.1 植物材料
供试金线莲分别为花叶开唇兰[A.roxburghii（Wall）Lindl]（俗称福建金线莲）和台湾开唇兰（A.formosauus Hayata）（俗称台湾金线莲），均采自福建明溪金草种业有限公司明溪标准化实验基地，由福建农林大学吴德峰教授鉴定。在培养室生根壮苗培养阶段，金线莲从2011年2月12日（培养室生根壮苗培养3个月）开始采收，每月采收一次，随机采样，一直采收到4月7日（生根壮苗培养5个月）。大棚移栽培植阶段从3月8日开始移植（生根壮苗培养4个月时进行移植）一直培植到9月6日，共6个月，每月采收一次，随机采样。金线莲大棚移栽后的管理措施与明溪标准化实验基地的日常管理措施一致。
1.2 试剂
D-无水葡萄糖标准品由中国药品生物制品检定所出品；无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司出品。
1.3 仪器
主要仪器有KQ-500DE型数控超声波清洗器、JL-300小型实验粉碎机、RE-52A型上海亚荣旋转蒸发仪、TDL-5-A型离心沉淀机、DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱、MDF-382E超低温冰箱、VFD-2000真空冷冻干燥机、UV-1800紫外-可见分光光度计。
2、样品处理
将金线莲鲜品置于烘箱中于50℃干燥至恒重，用小型粉碎机粉碎后过70目筛，置于密封袋中，备用。精密称取5.000g金线莲干粉，平行3份，置于250mL锥形瓶中，加入150mL超纯水浸泡过夜。
3、多糖的提取与纯化
将金线莲超纯水浸泡液用超声水浴加热（700C）提取2次，每次1h，合并提取液，冷却，抽滤，低温浓缩至100mL，待用。将得到的浓缩液加入30mL氯仿萃取，达到平衡后去除氯仿层，加入Sevag试剂（20mL氯仿、5mL正丁醇），剧烈振荡20min，于4000r/min离心10min，去除中间的灰色蛋白质层，重复4次，最后加入3倍体积的无水乙醇，置4℃的冰箱中过夜。于4000r/min离心15min，冷冻干燥18h后即得金线莲粗多糖。
4、多糖含量的测定
4.1 对照液的制备
精密称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品50mg，置于25mL容量瓶中，加入超纯水溶解后定容至刻度，得到2mg/mL葡萄糖标准液，备用。
4.2 标准曲线的绘制
参照文献中苯酚-硫酸法绘制。精密吸取葡萄糖标准液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00mL于50mL容量瓶中，室温下摇匀定容后备用。精密吸取1mL不同含量的葡萄糖标准液，置于10mL试管中，分别加入1mL 0.05mg/mL苯酚，摇匀后迅速沿试管壁加入5mL浓硫酸，摇匀后放入冷水中静置30min，在490nm波长处测定光密度（D）。以葡萄糖含量C为横坐标，D为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程：D=0.0100C+0.0593.r2=0.9981。结果表明，葡萄糖含量为10-80mg/L时与D呈良好的线性关系。
4.3 供试液的制备
取金线莲粗多糖25mg，用超纯水溶解后定容于100mL容量瓶中，按“1.4.2”的方法测定D，计算含量，所得数值乘以转化系数0.9校正多糖含量。
4.4 精密度试验
精密吸取0.5mL 2mg/mL葡萄糖标准液于10mL试管中，按“1.4.2”的方法测定D，重复测定5次，24h后再测定5次，求得日间RSD为0.72%，日内RSD为0.38%。
4.5 稳定性试验
将待测样品在490nm处在室温下每隔30min测定1次D，结果表明，待测样品3h内的RSD为0.29%（n=5）。
4.6 加样回收率试验
按低、中、高3个水平分别精密吸取1.0，1.5，2.0mL 2mg/mL葡萄糖标准液3份于100mL容量瓶中，每支容量瓶分别加入5mg己知含量的金线莲多糖样品，用超纯水定容，按“1.4.2”的方法测定D，得其回收率分别为100.3%，101.9%，99.4%。
4.7 多糖含量的测定
取2mL金线莲供试液按“1.4.2”的方法测定多糖含量，以2mL超纯水作对照。
二、结果与分析
1、生根壮苗培养阶段两种金线莲多糖含量的变化
由图1可见，从培养室生根壮苗培养阶段到大棚移栽培植阶段两种金线莲多糖含量的变化趋势基本一致，呈“双峰曲线”增长。在生根壮苗培养阶段，即生根培养3个月（2月12日采收）到5个月（4月7日采收），此时金线莲生长环境适宜，养分供应充足，多糖含量增长较快；生根壮苗培养5个月时福建金线莲多糖含量达188.1mg/g，台湾金线莲达179.7mg/g，福建金线莲的多糖含量略高于台湾金线莲。
由图1可见，从培养室生根壮苗培养阶段到大棚移栽培植阶段两种金线莲多糖含量的变化趋势基本一致，呈“双峰曲线”增长。在生根壮苗培养阶段，即生根培养3个月（2月12日采收）到5个月（4月7日采收），此时金线莲生长环境适宜，养分供应充足，多糖含量增长较快；生根壮苗培养5个月时福建金线莲多糖含量达188.1mg/g，台湾金线莲达179.7mg/g，福建金线莲的多糖含量略高于台湾金线莲。
2、大棚移栽培植阶段两种金线莲多糖含量的变化
大棚移栽培植阶段，由于移栽后生长环境发生很大变化，金线莲处于逆境生长环境中，代谢速率加快。大棚移栽培植阶段的前3个月主要靠先期积累的养分进行生理代谢的维持，而多糖作为金线莲的主要能量储备来源，此时大量消耗，多糖含量呈快速下降趋势，到第3个月时，含量达最低值，此时福建金线莲的多糖含量为22.7mg/g，台湾金线莲为39.0mg/g，福建金线莲的多糖含量低于台湾金线莲（图1）。
通过3个月的移栽适应，到第4个月（6月8日）两种金线莲多糖的含量开始出现增长趋势，此时金线莲己适应新的生长环境，自身光合作用的营养累积大于代谢消耗。移栽5个月（8月6日）台湾金线莲在高温环境下生长受到抑制，多糖含量开始呈下降趋势，移栽6个月时达到最低值；而福建金线莲移栽5个月时多糖含量仍有增加，移栽6月时也开始降低（图1）。
三、讨论
从生根壮苗培养阶段到大棚移栽培植阶段，福建金线莲和台湾金线莲全草多糖含量的变化趋势基本一致，但不同生长阶段多糖含量的变化差异较大。在生根壮苗培养阶段（生根培养3-5个月），两种金线莲的多糖含量均呈快速累积趋势，即随着培养时间的延长其多糖含量不断增长，这与杨翠芹等的研究结果一致。生根壮苗培养阶段，两种金线莲培养5个月时，其多糖含量均高于培养4个月的，因此，生产上若不考虑大棚移栽应在生根壮苗培养5个月时采收。
大棚移栽培植阶段，前3个月两种金线莲的多糖含量均呈下降趋势，移栽3个月后含量开始增长，移栽5个月时即8月上旬，多糖含量达到最大值，之后由于夏季高温天气，多糖含量又呈下降趋势，这与牛蓓等关于“高温抑制金线莲可溶性多糖累积”的报道一致。因此，笔者认为，若以多糖作为金线莲有效成分指标，并结合经济效益进行考量，在生产上若不考虑大棚移栽，应在生根壮苗培养5个月时采收；若选择大棚移栽，培植时间应在3个月以上，另外培植时应避开7，8月份的高温天气。
大棚移栽培植阶段，前3个月两种金线莲的多糖含量均呈下降趋势，移栽3个月后含量开始增长，移栽5个月时即8月上旬，多糖含量达到最大值，之后由于夏季高温天气，多糖含量又呈下降趋势，这与牛蓓等关于“高温抑制金线莲可溶性多糖累积”的报道一致。因此，笔者认为，若以多糖作为金线莲有效成分指标，并结合经济效益进行考量，在生产上若不考虑大棚移栽，应在生根壮苗培养5个月时采收；若选择大棚移栽，培植时间应在3个月以上，另外培植时应避开7，8月份的高温天气。